세포 생물학_세포 실험 Cell Biology_Cell Subculture Protocol

Cell Subculture protocol   세포 계대배양

 

PBS – washing 역할, 완충 용액

Trypsin - 세포를 dish 바닥에서 떼어내는 역할

 

①    PBS, Trypsin, DMEM Media 등 사용할 용액을 Water bath 37℃에서 warming 한다. (2-30분)

 

②    용액은 70% Ethanol로 닦은 후 Clean bench로 가져간다.

 

③    기존의 media는 suction하여 제거하고 PBS 5mL 또는 7mL로 washing 후 다시 suction.

Suction은 dish를 기울여서 실험한다 (바닥에 붙어있는 cell 손상 방지)

 

④    Trypsin을 3mL 분주하여 골고루 퍼지게 하고, 실온에서 2분 방치한다.

 

⑤    현미경을 이용하여 cell이 떨어졌는지 확인한다.

 

⑥    Media를 dish에 7mL 분주하여 dish 총량이 10mL이 되게 한다.

 

⑦    Dish를 기울여서 pipet aid로 pipetting을 10회 반복하여 cell을 모아준다.

 

⑧    Dish를 기울인 상태로 conical tube에 모든 용액을 옮긴다.

 

⑨    Conical tube를 원심분리한다. (1000, 3min centrifuge)

 

⑩    Centrifuge 후 가라앉은 cell 확인 후 suction으로 media만 제거한다. (cell 주의하여)

 

⑪    Conical tube에 다시 media 12mL 분주 후, dish에는 8mL씩 분주한다.

 

⑫    Conical tube의 media를 10회 정도 pipetting하여 cell을 풀어준다.

 

⑬    각 dish에 cell이 들어있는 media를 2mL씩 분주하여 각 dish의 총량이 10mL이 되게 한다.

 

⑭    Dish를 상하좌우로 살살 흔들어 고루 퍼트리고 현미경으로 관찰하여 cell이 잘 퍼졌는지 확인 후 incubator에 배양한다.